微囊藻毒素

微囊藻毒素是富營(yíng)養(yǎng)化的淡水水體中常見(jiàn)的藻類毒素，它是一類具有蛋白磷酸酶抑制和

強(qiáng)烈致肝癌作用的環(huán)狀七肽。目前已經(jīng)報(bào)道的微囊藻毒素已有 70 多種，其中微囊藻毒素 LR 是（microcystin LR, MC-LR）已知毒性zui強(qiáng)、急性危害zui大的一種淡水藍(lán)藻毒素。

以基因工程抗體技術(shù)的主流形式——噬菌體展示技術(shù)為例，目前利用噬菌體展示技術(shù)，篩選制備 MC-LR 的單鏈抗體或多肽配體的研究，已有少量報(bào)道。從鼠源合成噬菌體抗體庫(kù)中，快速分離獲得微囊藻毒素 LR 單鏈抗體

另外，由于單鏈抗體具有大規(guī)模、均一化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，有潛力應(yīng)用于微囊藻毒素 LR 的免疫學(xué)檢測(cè)或免疫親和柱的制備，同時(shí)也探索了一種的微囊藻毒素 LR 單鏈抗體的庫(kù)篩選、鑒定方法。

河豚毒素

 河豚毒素（TTX）是一種小分子量的、胍鹽神經(jīng)毒素它存在于河豚、蠑螈、斑足蟾等動(dòng)物中的海洋毒素。它主要通過(guò)抑制神經(jīng)或肌肉組織的鈉離子（Na⁺）電壓門控通道起作用，從而導(dǎo)致神經(jīng)麻痹、呼吸困難甚至是死亡。但是到目前為止，針對(duì)河豚毒素的有效的、快速靈敏的檢測(cè)方法還沒(méi)有出現(xiàn)，而發(fā)展針對(duì)河豚毒素的免疫學(xué)方面的檢測(cè)方法是非常有必要的。

抗河豚毒素的基因工程單鏈抗體的制備

首先通過(guò)一種化學(xué)方法（曼尼希反應(yīng)）來(lái)制備了河豚毒素的*人工抗原（TTX-BSA：作為檢測(cè)用抗原；TTX-KLH：作為免疫用抗原），并且采用了小量的、重復(fù)的免疫方式，實(shí)驗(yàn)組總共免疫了3只Balb/c小鼠。從免疫好的小鼠的脾臟中提取其全RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的*條鏈，以此作為模板通過(guò)常規(guī)的PCR反應(yīng)擴(kuò)增了抗體的重、輕鏈的可變區(qū)基因（V_H和V_L），配以適當(dāng)分子數(shù)的Linker（（G₄S）₃），通過(guò)重疊延伸PCR組裝成了一個(gè)可以無(wú)限制編碼抗河豚毒素（TTX）的重組的單鏈抗體（scFv）基因。通過(guò)噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)依托于噬菌體質(zhì)粒載體pCANTAB-5E的噬菌體展示文庫(kù)。在經(jīng)過(guò)輔助噬菌體M13KO7的再感染后，單鏈抗體就會(huì)展示在噬菌體的表面，然后再經(jīng)過(guò)六輪的淘選過(guò)程，我們獲得了可以和河豚毒素（TTX）特異性結(jié)合的抗體，并通過(guò)間接ELISA對(duì)其進(jìn)行了定量的分析，選定其中的一株親和力zui高的單克隆（scFv-T53）進(jìn)行了單鏈抗體的可溶性表達(dá)和各方面性質(zhì)的分析研究，通過(guò)間接ELISA測(cè)定選定的單克隆的親和力常數(shù)為1.1×10⁶L/mol。我們還通過(guò)生物信息學(xué)的手段，分析了scFv-T53的基因序列、氨基酸序列，預(yù)測(cè)了scFv-T53的可變區(qū)的劃分、二級(jí)結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)等。各種分析結(jié)果表面。本實(shí)驗(yàn)成功的從構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)中篩選得到了特異的抗河豚毒素（TTX）的單鏈抗體。

1 單鏈抗體的特點(diǎn)

單鏈抗體是一種新型重組蛋白,它是把抗體可變區(qū)重鏈(VH)與輕鏈(VL)通過(guò)一段約15~25個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的彈性短肽(Linker)相連而成,這種連接可以是VH linker VL,也可以是VL link-er VH。單鏈抗體是具有親代抗體全42部抗原結(jié)合特異性的zui小功能結(jié)構(gòu)單位,具有分子量小(僅為完整抗體的1/6)、對(duì)腫瘤的穿透力強(qiáng)、血流中半衰期短、免疫原性低、可在原核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)等特點(diǎn)。

2 單鏈抗體的研究進(jìn)展

2.1 單價(jià)單鏈抗體

1988年,Bird[2]和Huston[3]等zui先研究成功單鏈抗體,他們用PCR技術(shù)從雜交瘤細(xì)胞的基因組DNA或其RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA中擴(kuò)增出VH和VL基因,用編碼彈性短肽的寡核苷酸將兩者連接起來(lái),再將其插入原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而獲得,并發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中表達(dá)的單鏈抗體能自發(fā)折疊成天然構(gòu)象,其抗原親和性幾乎與完整抗體相同。1990年,Challdhary等[4]成功地制備了綠膿桿菌外毒素單鏈抗體基因,其表達(dá)的免疫毒素可識(shí)別并殺死攜帶OVB3抗原的細(xì)胞。在其后的十幾年時(shí)間里,研究人員進(jìn)一步嘗試用酵母或植物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)并獲得成功。

2.2 單鏈抗體多聚體

與典型的抗體不同,單價(jià)單鏈抗體只有一條輕鏈和一條重鏈,在與抗原結(jié)合方面還是稍遜于親本抗體,因此,人們采用易于形成螺旋或折疊的多肽基因,使其與VH和VL基因在表達(dá)系統(tǒng)中共同表達(dá),從而產(chǎn)生雙價(jià)單鏈抗體。對(duì)連接VH和VL的Linker長(zhǎng)度與單鏈抗體多聚體形成關(guān)系的研究認(rèn)為[5]:如果選用由甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)組成長(zhǎng)度為15~25個(gè)氨基酸殘基的Linker(序列為GGGGSGGGGSGGGGS),在折疊過(guò)程中,單鏈抗體的VH與VL功能區(qū)之間配

對(duì),形成單價(jià)單鏈抗體;如果Linker縮短為3~12個(gè)氨基酸殘基,則同一單鏈抗體分子的VH與VL區(qū)就不能相互配對(duì),而與不同單鏈抗體分子的VL與VH功能區(qū)配對(duì)成二價(jià)二聚體(即雙價(jià)單鏈抗體);如果Linker被進(jìn)一步縮短為1~2個(gè)氨基酸殘基,VH的C端殘基就直接與VL的N端殘基相連,兩個(gè)單鏈抗體分子首先構(gòu)成一個(gè)二價(jià)二聚體,兩端游離的VH和VL再與第三個(gè)單鏈抗體分子構(gòu)成三價(jià)三聚體。如果不使用Linker,則表達(dá)產(chǎn)物折疊后更易形成三價(jià)三聚體。

2.3 雙特異性單鏈抗體

人們發(fā)現(xiàn),可以利用兩種不同的單鏈抗體的VH和VL基因,使其在表達(dá)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)重新組合,形成具有雙特異性的單鏈抗體,這種雙特異性單鏈抗體可以同時(shí)與兩種抗原特異性地結(jié)合。與傳統(tǒng)的雙特異性抗體相比,雙特異性單鏈抗體既保持了特異性結(jié)合抗原的特點(diǎn)又具有以下優(yōu)點(diǎn):1缺失Fc片段,減少了與FcR陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性;ozui大限度地降低了鼠源性蛋白,降低了免疫變態(tài)反應(yīng)的可能性;分子量小,有利于穿透腫瘤組織;避免了傳統(tǒng)制備雙特異性抗體需要進(jìn)行細(xì)胞雜交的過(guò)程,減少了工作量,提高了制備的成功率。1993年Holliger等*次成功地制備了雙特異性單鏈抗體,目前已有十幾株抗體制備成功。

 單鏈抗體的不足與展望

單鏈抗體技術(shù)經(jīng)過(guò)了 20 多年的發(fā)展，取得了巨大的成就，但是在應(yīng)用中仍然存在一些問(wèn)題，如親和力較低，穩(wěn)定性較差，半衰期短等。

1. 單鏈抗體相對(duì)于其親本單克隆抗體，親和力低了 10-1000 倍，這成為它在免疫分析等應(yīng)用中的一個(gè)制約因素，可以通過(guò)親和力成熟對(duì)單鏈抗體的親和力進(jìn)行改進(jìn)，或者通過(guò)構(gòu)建多價(jià)抗體來(lái)增加抗體的功能親和性。
2. 單鏈抗體穩(wěn)定性差，常常顯示聚集傾向，尤其在 37℃時(shí)穩(wěn)定性較差，可以引入二硫鍵模擬天然狀態(tài)來(lái)穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，可使 VH 和 VL 形成穩(wěn)定的異聚體 dsFv，再用相應(yīng)載體系統(tǒng)進(jìn)行構(gòu)建。或者也可以將 ScFV 轉(zhuǎn)化為 Fab 做進(jìn)一步的分析。
3. 單鏈抗體分子質(zhì)量小，體內(nèi)清除速度快，有時(shí)候達(dá)不到治療或診斷的時(shí)間。針對(duì)這一缺點(diǎn)，可以從多方面對(duì) ScFv 進(jìn)行改造，增加其抗原結(jié)合力，提高其親和力，其中 ScFv 多聚體是其改進(jìn)形式之一，是通過(guò)將ScFv 連接肽縮短至 12 個(gè)氨基酸以下構(gòu)成的一種新型小分抗體，在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)具有很多優(yōu)勢(shì)，克服了 ScFv 在體內(nèi)清除過(guò)快的不足。但是，隨著分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)、單鏈抗體展示、表達(dá)技術(shù)研究的深入，獲得各種目的的單鏈抗體指日可待。