幾種常用的抗體檢測(cè)方法

(1)免疫酶技術(shù)
免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。
A、器材和試劑
a. 包被緩沖液：
碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調(diào)PH至9.6。
Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至1000ml。
b. 洗滌緩沖液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4&S226;12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。
c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。
d. 酶反應(yīng)終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。
e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此一次不宜配制過(guò)多。
f. 底物使用液：
OPD底物使用液（測(cè)490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。
TMBS或TMB底物使用液（測(cè)450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液（測(cè)410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。
g. 抗體對(duì)照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽(yáng)性血清。
h. 抗原： 可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。
病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗原。
淋巴細(xì)胞等懸液。
i. 酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo)SPA或其他類(lèi)似試劑。
j. 細(xì)胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。
k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。
l. 酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。
m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機(jī)等。
B、可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）
a. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。
b. 以50-100ul/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4℃一夜或37℃吸附2小時(shí)。
c. 棄去孔內(nèi)的液體，同時(shí)用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，拍干。
d. 每孔加200ul封閉液4℃一夜或37℃封閉2小時(shí)；該步驟對(duì)于一些抗原，可省略。
e. 洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可-20℃或4℃保存?zhèn)溆谩?br />f. 每孔加50-100ul待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；37℃孵育1-2小時(shí)；洗滌，拍干。
g. 加酶標(biāo)第二抗體，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小時(shí)，洗滌，拍干。
h. 加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分鐘。
i. 以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。
j. 結(jié)果判定：以P/N≧2.1，或P≧N+3D為陽(yáng)性。若陰性對(duì)照孔無(wú)色或接近無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。
C、  全菌抗原的ELISAS
a. 新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸餾水或PBS懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至1×108個(gè)/ml。必須指出，對(duì)于人畜共患病病原體需注意安全操作，是滅活處理。

b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小時(shí)，蒸餾水洗滌3次；加上述細(xì)菌懸液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封閉液4℃一夜或37℃ 2小時(shí)封閉。
c. 步驟b也可采用先每孔加50ul細(xì)菌懸液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃預(yù)冷的無(wú)水甲醇室溫作用15分鐘，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4℃一夜或37℃ 2小時(shí)封閉。
d. 洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可在-20℃或4℃保存?zhèn)溆谩?br />e. 以下步驟同上法。
D、  用全細(xì)胞抗原的ELISA
a. 按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS制成適當(dāng)濃度懸液。
b. 淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1500rpm離心30分鐘，吸取界面細(xì)胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞，離心后加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鐘，洗滌一次即可。將該細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度。
c. 每孔加100ul上述a或b的細(xì)胞懸液，使每孔含細(xì)胞5×104個(gè)；1500r/min 15分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分鐘；可4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?br />d. 以下步驟同上法。
E、抗體捕捉ELISA試驗(yàn)
本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb，再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；其操作步驟如下：
a.   以適當(dāng)濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標(biāo)板，每孔加100ul，37℃ 2小時(shí)或4℃一夜。
b.   洗滌、拍干后加待測(cè)的McAb樣品，37℃ 1-2小時(shí)。
c.   洗滌后加適量的抗原，37℃ 1-2小時(shí)。
d.   洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體，37℃ 1-2小時(shí)。洗滌后加底物顯色，判定結(jié)果。
F、ABC-ELISA試驗(yàn)
ABC-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，增加了生物素（Biotin）與親和素（Avidin）間的放大作用。親和素有4個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有高度的親合力。生物素很易與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。因此，結(jié)合了酶的親和素與結(jié)合有抗體的生物素發(fā)生反應(yīng)即起到了多極放大作用。其操作步驟如下：
a.   已知抗原的包被及加待檢McAb樣品，同間接ELISA試驗(yàn)。
b.   加生物素化抗鼠Ig抗體，每孔100ul，37℃ 1小時(shí)；洗滌。
c.   加酶標(biāo)親和素，每孔100ul，37℃ 30分鐘洗滌；加底物顯色，判定結(jié)果。
G、Dot-ELISA試驗(yàn)
免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（Dot-ELISA）是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固相載體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫檢測(cè)手段。該法采用不溶性底物（如DAB，或4-氯萘酚或AgNO3等），其與相應(yīng)標(biāo)記物（HRP、AP、膠體金）作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀著色，從而易于判定結(jié)果。根據(jù)所用的標(biāo)記物不同，可分為HRP 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、AP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和免疫金銀斑點(diǎn)法等。其操作步驟大致如下：
a.  將抗原液2-5ul點(diǎn)加于纖維素膜上，室溫37℃干燥。
b.  將纖維膜浸入封閉液中，37℃ 30分鐘。
c.  用洗滌液洗2次，吸干后加待檢McAb樣品，37℃ 1小時(shí)；用洗滌液振蕩洗滌三次，每次5分鐘，加HRP或AP或膠體金標(biāo)記的抗鼠Ig抗體，37℃作用30分鐘。
d.  同法洗滌，吸干，用新配的相應(yīng)底物溶液顯色，然后水洗終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。
H、免疫組化染色法
該法主要用于檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞抗原成分的McAb，常用的方法是間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)（IIP，indirect immunoperoxidase）及APAAP技術(shù)。其結(jié)果用光鏡或倒置顯微鏡檢查。

⑵ 免疫熒光技術(shù)
免疫熒光技術(shù)可用于多種抗原的雜交瘤抗體檢測(cè)，如細(xì)胞性抗原（包括細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞）、感染細(xì)胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡(jiǎn)單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點(diǎn)，在McAb的篩選與鑒定上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
A、器材和試劑
a.  供檢測(cè)抗體用的抗原制備—固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。
b.  PBS（PH7.2，0.01mol/L）
c.  待檢的McAb樣品。
d.  冷丙酮
e.  FITC（異硫氰酸熒光素）或TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明熒光素）標(biāo)記的抗鼠Ig抗體等
f.  熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機(jī)，水浴箱等。
B、間接免疫熒光法
a. 固定細(xì)胞片的制備：生長(zhǎng)在蓋片上的細(xì)胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片，在PBS中洗滌，用4℃丙酮固定10分鐘，空氣干燥，置密封容器于-20℃保存?zhèn)溆?；單?xì)胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。
細(xì)胞涂片的制備：將10ul細(xì)菌懸液（1×108個(gè)/ml）涂抹7×21mm蓋片上，自然干燥后，用-20℃丙酮固定10-15分鐘，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br />b. 蓋片在去離子水中濕潤(rùn)后置架上滴加10-20ul雜交瘤上清或其他待檢樣品；設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照；置37℃水浴孵育0.5-1小時(shí)。
c. 取出蓋片置PBS中用磁力攪拌器洗滌15分鐘。
d．   蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠Ig的熒光抗體10-20ul，37℃孵育0.5-1小時(shí)。
e． 同法洗滌15分鐘；取出蓋片，用延緩熒光碎滅的封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PBS）封于干凈載玻片上。
f. 光顯微鏡上觀察，陽(yáng)性結(jié)果可見(jiàn)特異性熒光（FITC為黃綠色熒光，TRITC為桔紅色熒光
g. 細(xì)胞固定片的制備，也可改在培養(yǎng)板孔中進(jìn)行，其余步驟同上，在觀察結(jié)果時(shí)，將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下，判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。
C、  細(xì)胞的膜熒光染色
完整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜，抗體不能透過(guò)。如果細(xì)胞在4℃操作，則熒光染色于細(xì)胞膜。必須注意死細(xì)胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗(yàn)過(guò)程中要保證細(xì)胞的高活力。活細(xì)胞的膜熒光染色大致步驟如下：
a.  制備活性較好的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至107個(gè)/ml。
b.  在小試管（5×50mm）中加入100ul細(xì)胞懸液，再加入100ul待檢McAb的樣品，混勻，4℃作用30-90分鐘。
c.  用洗滌液（PBS 900ml，小牛血清50ml，4%NaN3 50ml）洗二次，每次加洗滌液1-5ml，1000r/min離心5分鐘，棄上清。加入100ul熒光抗體，4℃作用30-90分鐘。
d.  同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于載玻片上，加蓋片封載。
e.  立即在熒光顯微鏡上檢查。
f.  細(xì)胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在4℃可保存一周。
⑶ 間接血凝試驗(yàn)
間接血凝試驗(yàn)又稱(chēng)被動(dòng)血凝試驗(yàn)（PHA），是目前應(yīng)用較廣的檢測(cè)方法之一。本試驗(yàn)是以包被可溶性抗原的紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上的抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象?？梢?jiàn)，該法具有靈敏、快速、容易操作和無(wú)需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，而且經(jīng)改用醛化紅細(xì)胞以后，克服原來(lái)重復(fù)性差的缺點(diǎn)。
A、  器材和試劑
a.   綿羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。
b.   緩沖液：PBS（PH7.2）；醋酸緩沖液。
c.   甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝劑等。
d.   血凝板，振蕩器等。
B、  多糖抗原的間接血凝試驗(yàn)
a.  甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：無(wú)菌采集綿羊頸靜脈血50ml，用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用5倍于紅細(xì)胞壓積的PH7.2 PBS（Na2HPO4&S226;12H2O 3.58g，KH2PO4 0.41g，NaCl 8.01g，蒸餾水1000ml）充分洗滌5次，每次1500r/min 5-10分鐘，直至上清測(cè)定無(wú)蛋白質(zhì)（用飽和硫酸銨滴定上清，觀察有無(wú)白色沉淀），再以相同緩沖液配成25%紅細(xì)胞懸液；將25%紅細(xì)胞懸液與20%甲醛以2.5：1的比例混勻，37℃水浴作用2小時(shí)，每15分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐漸由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?；以PH7.2 PBS洗滌4次，每次2000r/min 10分鐘，再以同樣的PBS制成25%紅細(xì)胞懸液；其后，重復(fù)醛化一次，方法同前；zui后配成20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸液，加甲醛至0.3%防腐，4℃保存?zhèn)溆谩?br />b.  脂多糖抗原致敏甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：取脂多糖（LPS），以0.2mol/L PH8.0 PB液，調(diào)整多糖濃度至120ug/ml，然后100℃水浴處理1小時(shí)；將冷卻至37℃的熱處理LPS與6%醛化紅細(xì)胞等量混合，37℃攪拌作用45分鐘；取出離心2000r/min 10分鐘，以0.01mol/L PH7.2 PBS洗滌4次；配制成4%致敏血球，分裝，保存于4℃?zhèn)溆?，或凍干保存?br />c.  McAb的篩選：取待測(cè)McAb樣品25ul，加入V型微量血凝板孔中，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照；再加入0.5-4%致敏紅血球懸液25ul，在振蕩器上混勻30秒；置室溫或37℃ 30-60分鐘觀察結(jié)果。陰性對(duì)照孔應(yīng)呈緊縮的圓點(diǎn)。
C、  可溶性蛋白抗原的間接血凝試驗(yàn)
a.  紅細(xì)胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人“O”型抗凝血，每次加10倍于紅細(xì)胞壓積的PBS洗滌4-6次，然后配成8%紅細(xì)胞懸液；向此8%紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS，于室溫緩慢攪拌17小時(shí)；其后洗滌3次，配成20%雙醛化紅細(xì)胞懸液，加0.1% NaN3防腐，4℃保存?zhèn)溆谩?br />b.  致敏紅細(xì)胞：取20%雙醛化紅細(xì)胞0.1ml，1500r/min 10分鐘，棄上清，沉積紅細(xì)胞加0.2mol/L PH4.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液1ml，并加zui適濃度（應(yīng)預(yù)先測(cè)定，蛋白抗原為50ug/ml左右）的抗原1ml，混勻，于45℃致敏30分鐘，有時(shí)輕輕搖動(dòng)，使紅細(xì)胞不下沉。然后離心去上清，并用20倍于紅細(xì)胞壓積的PBS洗3-4次，zui后用PBS配成0.5-1%致敏紅細(xì)胞，4℃保存?zhèn)溆谩?br />c.  McAb測(cè)定：同上法。

⑷ 放射免疫測(cè)定
放射免疫測(cè)定是用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，以檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體的定量方法。在篩選和鑒定單抗時(shí)常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以檢測(cè)樣品中的McAb，其操作步驟如下：
a.  用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至適宜的濃度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔內(nèi)，100ul/孔，4℃置夜或37℃ 2小時(shí)。
b.  棄去抗原液，每孔加100ul含0.5-1% BSA的PBS，4℃ 1-2小時(shí)封閉。
c.  用BSA-PBS洗滌3次，每次3分鐘。
d.  加待檢樣品，每孔100ul，設(shè)立陰性孔、陽(yáng)性孔和空白孔；37℃1-2小時(shí)，同法洗滌。
e.  每孔加125I標(biāo)記的抗鼠Ig抗體工作液100ul，37℃ 1-2小時(shí)，同法洗滌。
f.  用γ-射線閃爍計(jì)數(shù)儀分別測(cè)定各孔放射性。通常要求樣品孔和陽(yáng)性對(duì)照孔的放射性脈沖分別超過(guò)本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性為基準(zhǔn)，凡樣品孔與陰性孔放射性之比大于3的樣品定為陽(yáng)性。